浅谈体外诊断试剂与同类产品或方法比较结果的汇总和分析

一个新的体外诊断试剂的性能，通常通过对大量实际临床标本的检测结果进行统计、分析来综合考核与评价。与同类产品或方法比较，也是考核体外诊断试剂临床实际性能的重要内容，是综合评价新研发产品灵敏度和特异性的重要试验资料。

　　在实际临床考核中，进行对比研究时拟与新产品进行比较的应是经过多年实际应用、检测过大量临床标本的成熟且得到公认的同类产品或方法，它们的临床检测性能已经有了较好的研究基础。通过规范的对比研究，分析、总结新试剂与这些同类产品或方法平行检测相对小的样本量（相对于总体样本）的结果，可以间接推测出新试剂的性能。因此，与这些同类产品或方法比较的对比研究也就成为了目前考核新试剂临床灵敏度和临床特异性（与分析灵敏度和分析特异性不同）的重要试验之一。

　　在与同类产品或方法比较时，实验设计和结果汇总分析的正确与否将直接影响对新产品性能判断的结论。因此如何开展此方面的研究和评价，无论对研究者还是对评价者，都需要认真思考。根据审评工作的一些实际工作体会并参考国外文献，就临床考核中对比试验的有关问题撰写了此文，愿与大家共同讨论。

一、临床标本的选择：

　　最理想的就是选择的临床标本来自于真实的总体。但是，由于种种原因（比如，对待测靶标本的相关疾病在不同地区、时间、人群的流行规律的研究不是很清楚，等等），我们选择的样本与真实的样本总体的接近程度总会存在不同的差异，难以准确反映真实样本的原貌。因此，我们在试验中应尽力争取接近于真实的总体，在入选标本时要根据疾病的规律纳入一定比例、不同性别、年龄、可能存在干扰因素的阴阳性标本。总之，标本的选择要具有随机性和代表性，避免造成统计结果的偏倚。

二、对试剂或方法的要求：

　　使用在有效期内的试剂，严格按照试剂说明书操作。建议研发者提供的申报资料中最好有比较试剂或方法的详细背景资料（如：特殊原理、正常值、最低检出限、判定标准，等），包括说明书。

三、对检测结果的结果汇总、分析：

　　分以下不同情况进行分析。

　　1.有“金标准”方法或试剂，并且该“金标准”具有可操作性：

　　比较试剂或方法就采用“金标准”，平行检测入选标本，得出的阴阳性结果与“金标准”比较，就可得出新试剂的灵敏度和特异性。一个好的血清盘也可以作为“金标准”，比如：中检所建立的HCV抗体血清盘等。

　　举例如下：

根据上表，计算估计（estimated）灵敏度＝a/(a+c)×100%；估计特异性＝b/(b+d)×100%。

注：之所以称为“估计灵敏度”和“估计特异性”是因为选择的样本并不是真实的总体。

2.有“金标准”试剂或方法，但可操作性较差：

　　如果有“金标准”试剂或方法，但不实用，可以先采用一般同类产品比较，对于结果不一致的，再使用“金标准”试剂检测。并且，对于检测结果一致的标本，随机抽取，使用“金标准”试剂检测，进行调整。最后得出新试剂的临床灵敏度和临床特异性。当然，检测结果总结起来会比较复杂。

3.目前尚无明确的“金标准”试剂或方法：

　　没有“金标准”试剂或方法，就只能选择一般的同类产品比较，当然首选公认的性能好的。比较的结果可以采用2×2表统计，但不能用灵敏度和特异性表述了，只能称作符合率，因为它并不能反映真实值的情况。所以即使符合率均为100％，也不能说明检测结果都是正确的。

　　举例如下：

对结果进行分析，阳性符合率＝a/(a+c)×100%；阴性符合率＝b/(b+d)×100%；总符合率＝（a＋d）/( a＋b＋c＋d)×100%。对于检测不一致的结果可以进行临床追踪或使用第三种试剂或方法检测。

此外，得出的符合率的变化还依赖于疾病的流行情况（发病率），也就是说，如果选择的人群发生变化，符合率也会发生改变。下面举例说明：

　　下表是同类产品与新试剂的比较，并且列出了假定的真实值分布情况：

据上表，发病率为23.2%(51/220)，在患者中两试剂的符合率为88.2％[（39＋6）/51]；而非患者中，两试剂的符合率为98.2％[（1＋165）/169]，总的符合率为95.9％[（39＋6＋1＋165）/220]。

如果疾病的流行率降低，非患者由169增为676，其结果如下表：

经统计，结果——发病率为7％[51/（51＋676）]，在患者中两试剂的符合率为88.2％[（39＋6）/51],而非患者中，两试剂的符合率为98.2％[（4＋660）/676]，但是总的符合率却发生了变化，为97.5％[（39＋6＋4＋660）/727]，略高于原来的95.9％。更令人惊讶的是，新试剂与非金标准试剂的阳性符合率降低为76.8％[43/(43+13)](原为90.9％)；新试剂与非金标准试剂的阴性符合率增加为99.2％[666/(666+5)](原为97.2％)。　　总之，诊断试剂与同类产品或方法比较只是临床考核中的部分内容，在进行结果汇总和分析时除遵守上述基本的原则外，要尽可能的体现其在实际临床使用中的真实性能。在临床考核中，可以选择多家同类产品或多种方法进行比较。对于定量诊断试剂，还要进行有关定量方面的考核研究。

以上是个人的一些认识，欢迎大家共同讨论。

参考文献：

Statistical Guidance on Reporting Results from Studies Evaluating Diagnostic Test；Draft Guidance for Industry and FDA Reviewers（2003.03.12）。

对体外诊断试剂多样性和复杂性的思考

   体外诊断试剂的品种和种类繁多，以方法学分类有酶免、放免、荧光和化学发光、分子生物学、免疫组化、免疫细胞化学等，以检测对象分类有细胞水平、蛋白分子水平以及基因水平等的检测对象，以临床应用上分类有初筛、初筛后确证、诊断和疗效观察等，以所使用的技术分类有标记免疫技术、分子杂交技术、基因扩增技术等。由此可见体外诊断试剂的多样性和复杂性。

体外诊断试剂的多样性和复杂性还表现在，多数产品存在着没有相对应的参考方法和标准品难以获得的问题，给体外诊断试剂的审评带来了一定的困难。本人体会目前体外诊断试剂的标准化只能是一个相对的概念，而如何将标准化建立在实际可操作水平上，将体外诊断试剂的审评达到一个相对的合理、高效、规范，是值得思考的问题，就上述问题，浅谈个人的一些体会。

影响体外诊断试剂质量的因素主要有原材料的选择、生产工艺、标准品和质控品建立和标定、临界值的确定、曲线拟和方式、实验设计、实验技术、被检测标本种类等等，由于上述种种影响因素，导致了体外诊断试剂的多样性和复杂性，故在审评中需将不同的品种的共性和各自的特殊性综合考虑，使其审评要点达到相对统一的水平上，以便完成对每一个产品的审评。

对于原材料要考虑其选择的依据和合理性，应有相关的检定包括，如抗原抗体的纯度、特异性、亲和力等；其次应有质量可控性的指标如效价；对于生产工艺要考虑应有标记物和标记方法的建立、反应体系建立过程，是否进行了优化，是否根据实验结果建立质控点和反应体系；对于临界值的建立首先要分别确认病理临界值、医学决定性水平和正常值参考范围，前两者要靠大量的循证医学来获得，后者要依据大量的统计学分析和所用技术的分辨力来综合确定，并通过临床考核和成品性能来验证；对于标准品和质控品首先应保证其溯源性，其次关注其成分、标定（或校准）过程和标定结果，对无溯源性的参考品的建立应选择具有溯源性的参考方法来确定其参考值，则可使标准化达到一定的水平；实验设计如竞争法和非竞争法的不同往往会涉及到生产工艺、剂量反应曲线、反应动力学和临界值的不同；对于采用的实验技术不同的品种，如固相酶免、磁珠酶免、胶体金、芯片等，则会存在所选用原材料、生产工艺、反应体系及结果处理方法各不相同，需要根据不同技术特点来关注其质控点和可控性进行审评。

综上所述，我认为，虽体外诊断试剂品种各不相同，但产品的合理性和可控性，可直接反映到成品性能和临床考核的验证上，若将上述审评作为“一般审评”的话，其成品性能和临床考核的审评应作为“重点审评”，但“一般审评”是“重点审评”的基础，两者缺一不可。成品性能和临床考核应考核其品种的合理性、完整性和局限性，这样有助于我们对产品的把握。

生化试剂应用常见问题的探讨

1 试剂空白

试剂空白吸光度是反映试剂质量的指标之一。每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示该试剂的变质；如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因含酚类物质被氧化为醌而变为红色。碱性磷酸酶、r一谷氨酰转肽酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或酚基苯胺而变黄。有些试剂久置后变浑浊。这些情况均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应，在放置过程中其试剂空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降。原则上，吸光度上升的反应，其试剂空白吸光度越低越好，不能超过一个高限；相反，吸光度下降的反应，其试剂空白吸光度不能低于一个低限。因此，试剂空白吸光度限值，常作为程序参数输入仪器，如经核查超限，仪器会自动报警，提示更换试剂。需要指出的是，还原型辅酶I(或II)等投料量不足或劣质的原料，往往需要加大用量，才使“表观”吸光度上升，凑合过试剂空白核对的“关”，其后果为如下情况：

1．1 线性范围变窄 现象：高值测不高。原因：生产试剂时有效成分投料量不足；试剂成份稳定性较差。

1．2 灵敏度变低现象：酶促反应速度曲线斜率下降，测定结果有严重系统误差。原因：试剂底物浓度不足。

1．3 低值偏高 现象：试剂空白的变化曲线(吸光度VS时间)明显波动。原因：试剂自身不稳定，自行分解；工具酶纯度

不够，杂酶含量超限，导致干扰作用。

2 样品信息

样品的溶血、脂血、黄疸等会对测定结果产生非化学反应的干扰。因此，应根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，采用双波长或多波长的检测模式，并在结果计算中扣除因溶血、脂血、黄疸引起的影响，减少干扰程度。

3 测定范围

每种待测物都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果若超过此范围，分析仪将显示结果超过范围的提示。表示试剂已经变质，应更换合格试剂。

4 底物耗尽

使用连续监测法、两点法测定酶活性时，若酶活性非常高，底物接近被耗尽，吸光度上升或下降会超过某一吸光度变化范围，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不可靠。

5 酶的预活化

测定血清中的某些酶，如CK，离体(采血)后很容易失活。失活的原因是酶活性中心的活性基因巯基(一SH)被氧化造成的。只有通过适当的还原作用才能重新激活。如CK—NAC试剂盒即含有CK活化剂，名为N一乙酰半胱氨酸。实验研究证明，NAC对血清中已失活的CK活化过程约需180 S。这就是CK测定为什么要延迟时间较长的理论依据。在AST，ALT采用IFCC推荐方法测定时需要磷酸吡哆醛预活化。需要强调：含有活化剂的生化试剂，其测定酶活性的结果要高些。

6 校准与结果溯源性

酶的校正：要满足在同一方法学、同一测定条件、与理论计算的FACTOR值差异不大，没有发现有明显影响因素，方可

进行校正。

检验结果溯源性，得建立一个可靠的参考系统作为准确性基础，然后将准确性转移到常规方法测定中去，使常规方法测定结果可溯源到参考系统所提供的准确性基础上来。在实现溯源性目标过程中，永远以患者新鲜标本为实验对象，以方法学对比试验方法为验证手段。方法学对比试验常采用回归方程进行统计分析，假如斜率接近1，截距较小，这意味着实验室常规方法对标本测定结果和溯源目标参考系统对标本检测结果非常接近。

临床化学中参考标准(二级标准)要有通用性，但生产厂家提供的校准液并非通用的，只适用于某一特定的分析系统。

校准液标示值往往是按其基质偏差修正的，所以标示值并非实际值。校准液、质控血清通常是经过处理的混合人或动物血清，这种制备物在特定分析系统中往往与人新鲜血清反应性不同而产生基质偏差。如总胆固醇测定基质效应研究指出：校准液酶法测定回收结果偏低可达5%~7%。

7 试剂抗干扰作用的合理性有些液体双试剂，其实质并不真正具备抗干扰的能力而只是解决了试剂的液体化和稳定性问题。如，ALT试剂盒中，NADH在pH7.5~7.8水溶液中极不稳定，在pH>8.7时才能稳定保存。因此，为了保证试剂稳定性，液体双试剂的R1需要维持pH>8.7，但此时LDH活性大大下降，就失去消除内源性丙酮酸的功能，只有加入试剂R2后，反应混合液的pH下降至LDH最适pH，在经过延迟时间60 S后，才能消除内源性丙酮酸的干扰。再如，Tfinder反应中抗Vc干扰问题：由于维生素c易氧化，样品中Vc会竞争反应生成的过氧化氢，而产生负干扰。因此，在试剂R1中加入抗坏血酸氧化酶，这种方法是有效的，但不一定有很大的意义。因为Vc干扰必须同时具备二个条件：a)Vc摄入量较多；b)采血后立即测定。实验表明离体血清中Vc在90 min后会全部被氧化。又如，使用胺类新色原。a)分子共轭结构特性使得灵敏度提高，相应可以减少样本用量，最终能有效地降低干扰物的量．b)使生成胺类色素原最大吸收峰由500~520 nm移至550 nm以上，以避开黄疸、溶血干扰。如：亚铁氰化钾一H 0 ，能有效避免黄疸干扰的理论依据是亚铁氰化钾与H。0。亲和力远远大于胆红素。

甘油三酯测定，有人主张选用双试剂方法消除内源性甘油，这个方法是可行的，但忽视了一个化学平衡理论。因为所有的酯在水溶液中都不是简单地以酯的形式存在，而是以水解与酯化相平衡的形式存在。在一个平衡体系中，如果去除游离甘油，这个平衡就向生成甘油方向移动，甘油三酯就会重新水解，生成新的甘油，达到新的平衡，因此样品与R1试剂孵育时间越长，测得甘油三酯值就越低。甘油三酯测定，不仅要去除游离甘油，而且还要克服样本含量真实性发生的变化，试剂中必须加入甘油激酶，并且延迟时间要标准化。所以，一些试验项目在消除内源性物质干扰的同时，会带来样品含量真实性的变化。

参考文献

[1]韩志钧，黄志锋，卢业成，主编．临床化学常用项目自动分析法[M]．沈阳：辽宁科学技术出版社，2005．29—112．

[2]张万忠．临床生化试剂盒质量评估方法[J]．上海医学检验杂志，1991，6(4)：213．

[3]陆永绥，张伟民，主编．临床检验管理与技术规程[M]．杭州：浙江大学出版社，2004．588—592．

[4]冯仁丰，编．临床检验质量管理技术基础[M]．上海：上海科学技术文献出版社，2003．96-97．

移液器使用注意事项

设定移液体积

从大量程调节至小量程为正常调节方法，逆时针旋转刻度即可

从小量程调节至大量程时，应先调至超过设定体积刻度，再回调至设定体积，这样可以保证移液器的精确度

2．装配移液枪头

将移液枪垂直插入吸头，左右旋转半圈，上紧即可。

用移液器撞击吸头的方法是非常不可取的，长期这样操作回导致移液器的零件因撞击而松散，严重会导致调节刻度的旋钮卡住

3．吸液及放液

垂直吸液

吸头尖端浸入液面3mm以下，吸液前枪头先在液体中预润洗

慢吸慢放

放液时如果量很小则应吸头尖端可靠容器内壁

4．吸有液体的移液枪不应平放，枪头内的液体很容易污染枪内部而可能导致枪的弹簧生锈

5．移液枪在每次实验后应将刻度调至最大，让弹簧回复原型以延长移液枪的使用寿命

6.吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气。

7.为获得较高的精度，吸头需预先吸取一次样品溶液，然后再正式移液，因为吸取血清蛋白质溶液或有机溶剂时，吸头内壁会残留一层”液膜”，造成排液量偏小而产生误差。

8.浓度和粘度大的液体，会产生误差，为消除其误差的补偿量，可由试验确定，补偿量可用调节旋钮改变读数窗的读数来进行设定。

9.可用分析天平称量所取纯水的重量并进行计算的方法，来校正取液器，1mL 蒸馏水20℃时重0.9982g.

所设量程在移液器量程范围内不要将按钮旋出量程，否则会卡住机械装置，损坏了移液器。

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10在设置量程时，请注意：数字清清楚楚在显示窗中， 旋转到所需量程

11.移液器严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性的液体（如浓酸、浓碱、有机物等）。

12.严禁使用移液器吹打混匀液体。

13.不要用大量程的移液器移取小体积的液体，以免影响准确度。同时，如果需要移取量程范围以外较大量的液体，请使用移液管进行操作。

一些检测项目如钙、胆固醇、乳酸脱氢酶等试剂中含磷酸盐缓冲液；三酰甘油、肌酸激酶试剂中含有镁离子；淀粉酶试剂中含有醋酸钙。所以在使用试剂时若不仔细阅读说明书，就容易发生项目组合时因试剂成分对检验结果产生交叉污染。本实验结果显示，在没有污染的情况下，第1种方式测定结果列为观察依据，第2种方式明显升高，无机磷高达1 mmol/L，钙高达0.2 mmol/L，说明仅靠仪器内部蒸馏水1次冲洗不能解决上次检测试剂残余对下次检测的污染。第3种方式是中间隔1次非污染项目，结果还存在明显影响。通过本实验说明在使用全自动生化仪时，设置某些项目时应特别注意位置的放置。

同时我们还发现尿酸试剂受到强酸性试剂影响结果明显偏低现象。说明这类污染还有多种表现，受影响的项目不少。所以根据我们的经验，只要合理安排位置，就可有效地避免这种现象发生，也可以增加对吸样针的清洗次数来减少这样的误差。

做临床生化质控的几点体会

随着现代医学的飞速发展，检验科的地位显得越来越重要，特别是检验科在检测项目的多样性及不同的针对性上有了很大的提高而受到临床科室的重视。如何进一步提高检验质量，保证检验结果准确性，并将其纳入标准化，科学化的统一管理轨道，已成为检验工作者急需思考和解决的主要课题之一。近几年在室内质控以及参加湖北省临检中心的生化质评活动中，我们做了一些工作，取得了较好的成绩，为日常工作打一下了坚实的基础。回顾以往每次质评，有以下几点体

会。

1 人员的因素是做好生化质控的前提这其中包括各级领导的重视，临床医护人员对检验科的了解程序及检验科各级人员的重视程度。如有哪项指标不合格，即可禁止该实验项目的开展权。这不仅对检验科也对医院的社会效益和经济利益带来了不可估量的影响。目前在我国的医院等级评审制度中将检验科生化质控成绩作为医院达标的指标之一。鉴于以上形式，各级领导包括检验界，医院领导，科室领导以及生化室负责人都对质控提高了认识，引起了重视，加强了统一管理，但是光有重视还不够，必须采取切实可行的有效措施保证生化质控，如国家卫生部检验中心和各省临检中心组织的室间生化质评工作，各级医院领导可大力较强检验科与临床的合作，保证生化质控的分析前质量等等。各级临床医护人员除了解检验科各个项目的临床意义外，更应熟悉检验科对不同项目采集标本的具体要求。比如不同项目的抗凝剂，防腐剂以及不同标本收集时应注意的具体事项。首先护理人员应该严格保证所采集的标本的正确与合格，因为质控和平时常规标本的检测之间是相辅相成的关系。

2 试剂质量是做好生化质控的一个基本因素 自动化生化分析仪在临床的进一步广泛应用带动试剂的商品化。现在检验科自配试剂已呈逐年减少的趋势。国内国外实践竞争上市，总体来讲国外试剂在质量上要优于国内产品。这其中包括是、试剂的稳定性，实际的线性回归，试剂的储存及使用前配置等方面。但其价格昂贵却又让有些医院望而却步。总之一种新试剂来后，一定要做以下几个实验：试剂的稳定性试验，线性回归试验，试剂的选择同时还涉及到方法学的问题，不同试剂代表不同的方法。其参考值也就有所变化。所以这就要求试剂厂家尽量提供国际单位和适应范围较广的参考范围。有些国外试剂提供的参考范围不一定适合于国内，这就必须自作普查，特别是部分酶学的测定，由于方法学的不一样参考值的变化较大，容易引起误解。同时试剂的预配置，波长的选择，定标时间以及反应试剂量等，厂家都作了精确的测试，一般不需要改动。除非检验人员亲自做了相关实验，否则将引起质控工作的紊乱。

3 仪器稳定性及维护也是做好生化质控的一个重要因素医学检验作为一个技术性特别强的学科，其技术发展日新月异，尤其是生化检验，自动化生化分析仪在大中型医院得到广泛的应用。由于国外不同厂家的设备纷纷挤入中国，而很多医院设备科缺乏对各种设备的信息比较，对其性价比缺乏相应的了解。每个医院的质量差别也较大。这给生化质控工作带来极大不便，既影响室内质控的稳定性也造成室问质评紊乱。

现在医院应建立检验中心，在一个地区同型号的多台生化分析仪，应保证实践和室内质量控制。既有利于管理也将极有力保证检验结果的权威性和可比性。

4 正确选择质控物和参考血清也是做好生化质评必不可少的一方面室内质控血清的质量是保证获得良好的质控结果的重要前提之一，因此一定时间内最好是用同一种性能稳定的质控物，这样既保证了检验结果的准确性也有利于同一患者在同一医院测定结果的前后对比性。当然室内质控也应采用高中低三个水平。这样就可避免有些临床标本结果太高或太低而偏离线性范围而导致失控，这是不太完善的。关于室间质评，现在有一些不良去向，即一味追求室间质评的成绩而忽略了室内质控，以至于主次颠倒。实质上室间质评是室内质控的辅助，只有做好室内质控才能保证临床标本检测的准确性及室问质评的进行。

总之临床生化人员应按这些要求去重视质控的工作，相信临床生化检验会上一个新的台阶，生化质控也会有一个质的飞跃。